Az Eritromicin gyakran alkalmazott makrolid típusú antibiotikum az állatgyógyászatban, amely intenzíven metabolizálódik a májban. Kísérleteink során in vitro körülmények között vizsgáltuk a hatóanyag koncenctrációjának változását különböző mennyiségű nátrium-butirátot tartalmazó májsejttenyészet mintákban, valamint házityúk vérplazma mintákból határoztuk meg az Eritromicin koncentrációkat a különböző kintekiai paraméterek meghatározása céljából.
Célkitűzésünk olyan szelektív, érzékeny, rutinszerűen is alkalmazható nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszer kidolgozása volt, melynek alkalmazása lehetővé teszi a különböző sejttenyésző tápoldat és plazma mintákból az Eritromicin meghatározását.
Az Eritromicin kis koncentrációban csak származékképzéssel egybekötött fluoreszcens detektálás alkalmazásával határozható meg. Vizsgálatainkhoz fluorenilmetil kloroformiát származékképző szert alkalmaztunk, a mintaelőkészítés során pedig folyadék-folyadék extracióval nyertük ki a hatóanyagot a sejttenyésző tápoldat és plazma mintákból. A mérésekhez un. fordított fázisú folyadékkromatográfiás rendszert alkalmaztunk C18 típusú állófázissal és fluoreszcens detektálással.
A HPLC-s módszer kidolgozása során optimalizáltuk a mintaelőkészítést, a származékképzést, valamint a HPLC-s mérés paramétereit. A folyadék-folyadék extració kidolgozásánál optimalizálni kellett a vizes és a szerves fázis arányát, valamint a vizes fázis pH-ját, míg a származékképzés beállításánál a származékképző szer koncentrációját, a reakció időt és hőmérsékletet kellett vizsgálni. A HPLC-s meghatározáshoz ki kellett választani a megfelelő C18 típusú (Nucleosil) állófázist, be kellett állítani a megfelelő gerjesztési és kibocsátási hullámhosszakat (260 ill. 315 nm), valamint a folyadékkromatográfiás mozgófázis összetételét úgy kellett kialakítani (70/30 acetonitril/0,03M foszfát puffer, pH=7,2), hogy a mért hatóanyag szelektíven meghatározható legyen a különböző sejttenyésző tápoldat és házityúk vérplazma mintákból.
A rutinszerű alkalmazás előtt a módszert néhány paraméter (specificitás, linearitás, visszanyerés, reprodukálhatóság, kimutatási határ) vizsgálatával validáltuk, majd a különböző mennyiségű nátrium-butirátot tartalmazó sejttenyésző tápoldat mintákból (májsejttenyészet tartalmú és kontrol), valamint a kezelt házityúkok vérplazma mintáiból elvégeztük az Eritromicin HPLC-s meghatározását.