A PhD kutatói munkámat megalapozó, in vivo állatkísérleteket megelőző in vitro módszer alkalmazása, amely a Harvard Egyetem kutatói által 2016-ban kidolgozott ún. Mega-plate, azaz egy nagyméretű (1200×600 mm) tenyésztőedény magyarországi első megvalósítása (600×300 mm). Ennek segítségével modellezzük in vitro az E. coli növekvő antibiotikum koncentrációk ellen kialakuló rezisztenciájának evolúcióját, valamint molekuláris genetikai vizsgálatok segítségével nyomon követjük és feltérképezzük a rezisztenciáért felelős gének alakulását a baktériumok szelekciója során.

Az első mérföldkő a rendelkezésünkre álló termosztát méretéhez igazított Mega-plate (600×300 mm) tenyésztőedény összeállítása, az edény hatékony sterilizálásának kidolgozása, valamint működésének tesztelése.

A második mérföldkő az egyes antibiotikumok vizsgálata. Az ATCC 25922 nemzetközi E. coli törzset használjuk, először meghatározzuk az adott antibiotikummal szembeni MIC-értékét, majd ez alapján és a CLSI szabvány ajánlása alapján kiszámoljuk a kezdő, 1x antibiotikum dózist. A Mega-plate edény segítségével modellezni tudjuk in vitro körülmények között az E. coli adott antibiotikum hatóanyagok 1x, 10x, 100x, 1000x növekvő koncentrációja ellen kialakuló rezisztencia időbeni lefolyását. Vizuálisan is jól láthatóvá válik a baktériumok mutációja és szelekciója, az egyes antibiotikum koncentráció-határok áttörése révén. Az edényt 9 egyenlő sávra osztjuk, a két szélső sáv táptalajába nem kerül antibiotikum. Mindkét oldalról kiindulva a 2. sávba egyszeres, a 3. sávba tízszeres, a 4. sávba százszoros, végül a középső sávba ezerszeres koncentrációt tartalmazó táptalaj kerül. Majd a két szélső sávba szélesztjük az érzékeny baktériumtörzset. Egy-egy antibiotikum vizsgálata 12-15 napot vesz igénybe, ennyi időbe telik, amíg áttöri a baktérium az összes antibiotikum koncentráció-határt. Ezt követően az egyes sávokból baktérium mintákat veszünk, majd meghatározzuk az új MIC-értéküket, végül új generációs szekvenálás segítségével feltérképezzük az antimikrobiális rezisztencia génkészletet, az egyes gének kromoszómán, plazmidon vagy fágon való kódolását, azok mobilis genetikai elemként való kódolását és a mutációs-szelekciós nyomás hatásait vizsgáljuk pontmutációk kimutatása segítségével.